sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 SDS—PAGE的基本原理
原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用电荷效应和分子筛效应分离鉴定蛋白质的技术。通过与标准样品的对比，可以确定蛋白质带中的成分。为了利用凝胶电泳测量样品蛋白质的分子量，需要消除电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量。
加入一定浓度的十二烷基硫酸钠 (SDS) 即可实现这一目的。这种阴离子表面活性剂的浓度大于 1 mmol/L 时，以 1.4 克 SDS 与 1 克蛋白质分子结合形成复合物，使蛋白质带负电荷。这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差异，从而降低或消除了各种蛋白质天然电荷差异。巯基乙醇可以还原蛋白质分子中的二硫键，使多肽组分变成单个亚基。
SDS 可以打断蛋白质的氢键，因此与蛋白质结合后还会引起蛋白质构象的变化。这种复合物的流体力学和光学性质表明它们在水溶液中的形状近似于长椭圆棒状。不同蛋白质-SDS 复合物的短轴相同，约为 1.8nm，而长轴的长度与蛋白质的分子量成正比。
各种 SDS-蛋白质复合物在电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是按照分子的大小通过凝胶的分子筛效应进行分离。它们的有效迁移率与分子量的对数成线性关系。这样，我们就可以根据标准蛋白质分子量的对数与迁移率绘制的标准曲线，推断未知样品蛋白质的分子量。
材料、设备和试剂
材料
- 小麦芽
设备
1. 垂直板电泳槽及附件
2. 直流稳压稳流电泳仪
3. 微量进样器
4. 其他常用器具
试剂
1. 下层胶缓冲液：18.17g Tris，0.4g SDS，溶解在水中，用 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 8.8，定容至 100ml。
2. 上层胶缓冲液：6.06g Tris，0.4g SDS，溶解在水中，用 1mol/L 的 HCl 调节 pH 为 6.8，定容至 100ml。
3. Acr/Bis 储备液：30g Acr，0.8g Bis，溶解后定容至 100ml。
4. 10% 过硫酸铵：现用现配。
5. 样品缓冲液：Tris 0.6g，甘油 5ml，SDS 1g 溶解在水中，用 HCl 调节 pH 为 8.0，再加入溴酚蓝 0.1g 和巯基乙醇 2.5ml，定容至 100ml。
6. 电极缓冲液：Tris 3.03g，Gly14.14g，SDS 1.0g，溶解在水中，用 HCL 调节 pH 至 8.3 定容至 1000ml。
7. 染色液：45% 甲醇，0.25% 考马斯亮蓝 R-250。
8. 脱色液：2.5% 甲醇，10% 醋酸。
9. 1.5% 琼脂：1.5g 琼脂溶解在 100ml 电极缓冲液中，加热溶解。
10. 标准分子量蛋白质。
实验步骤
1. 电泳槽的安装：
将干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，四周用 1.5% 的琼脂密封。
2. 样品处理：
将各种标准蛋白质和待测样品分别溶解在蛋白质处理液（浓度 2mg/ml中，在沸水中加热 3-4 分钟，待冷却后用于点样。
3. 制胶：
选择合适的胶浓度，按照下表配制 7.5% 的分离胶，混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡，加到距短玻璃板上边缘 3cm 处，立即覆盖 2-3mm 的水层，静止聚合约 40 分钟左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插入有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。
4. 点样：
用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液 5μl，按分子量（从小到大的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液 25μl，注入其他样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。
5. 电泳：
加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正，调节电流为 15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到 30mA，电压恒定在 80-100 伏之间，约 3-4 小时后，指示剂达到距前沿 1-2cm 时，可终止电泳。
6. 固定：
胶取出后，在水中浸泡 10 分钟，浸出部分 SDS，然后将胶浸泡在 25% 异丙醇和 10% 乙酸的混合液中 1 小时，蛋白质就固定了。
7. 染色：
取出凝胶板，测定胶长 (D1) 后，加入染色液染色 2 小时。
8. 脱色：
将胶放在脱色液中脱色 0.5 小时，每隔 0.5 小时换一次脱色液，至少换 3 次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长 (D2)。
蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算
迁移率计算：
根据蛋白质分子量对数与电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为 d1，蛋白质迁移距离定为 d2，并以 D1 定为凝胶染色前的长度，D2 定为凝胶染色后的长度。根据以下公式计算各种蛋白质的迁移率 Rm：
Rm = d2d1 × D1D2
分子量计算：
以标准蛋白质的迁移率为横坐标，以其对应的分子量对数为纵坐标，绘制标准曲线，可得到一条直线。然后根据未知样品的迁移率，在半对数坐标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。
